Kolik typů buněk?

Vědci mají více informací než kdy jindy o tom, jak se buňky liší, ale buňky stále odolávají snadnému seskupování.

Problém buněčných typů se objevil v roce 2013 genomickému biologovi Jasonu Buenrosrovi. Studoval buněčnou linii získanou od lidského pacienta s rakovinou a pokusil se určit, jak je DNA uspořádána v jádře. Podle jeho názoru měly být všechny buňky téměř totožné. Ale čím více se Buenrostro díval na DNA, tím více rozdílů nacházel v jejím obalu. „Uvědomil jsem si, že pravděpodobně existují stovky možností,“ vzpomíná Buenrostro. Tato a další studie ho vedly k závěru, že „každá buňka je jako jedinečná sněhová vločka“. A toto zjištění výrazně zkomplikovalo jeho výzkum toho, jak si některé rakovinné buňky vyvinou rezistenci vůči lékům. Pro Buenrostra, nyní na Harvardské univerzitě, to znamenalo, že „všechny tyto buňky sněhových vloček mohou být ve skutečnosti důležité“.

Přes jejich individualitu existují pragmatické důvody pro seskupování podobných buněk do skupin. „Identifikace typů buněk je zásadní pro pochopení nových biologických jevů, objasnění základních mechanismů a identifikaci terapeutických cílů,“ říká Zhang Zhang, bioinformatik z Pekingského institutu genomiky Čínské akademie věd.
Projekty na vytvoření obrovských atlasů buněk již generují množství dat a umožňují nám pochopit podstatu nemocí. Od poloviny roku 2010 se vědci pracující na klasifikaci buněk silně spoléhali na jednobuněčné sekvenování RNA, což je technika, která dokáže identifikovat geny zapnuté v každé buňce a seskupit buňky s podobnými profily. Mezinárodní spolupráce Human Cell Atlas, zahájená v roce 2016, analyzovala více než 90 milionů buněk od více než 11 000 lidí v neustálém úsilí vytvořit 18 různých atlasů a publikovala více než 440 studií.

Ale za tímto pokrokem se skrývá zdánlivě jednoduchá otázka: co je to typ buňky? „Typ buněk je skupina buněk, které jsou si navzájem podobné a liší se od ostatních skupin buněk,“ říká neurolog Hongkui Zeng, ředitel Allenova institutu pro výzkum mozku. Ale i tato definice ponechává velký prostor pro interpretaci: jak podobné? jaký je v tom rozdíl? Zeptejte se tuctu výzkumníků a dostanete stejně mnoho různých odpovědí. Ve skutečnosti, když v roce 2017 časopis Buněčné systémy provedl podobný průzkum, 15 výzkumníků nabídlo zcela odlišné možnosti, přičemž poukázali na vývojovou historii, molekulární profil, formu nebo funkci jako možné identifikátory. „Diskuse může být docela vzrušená,“ říká Buenrostro.

Možná je to způsobeno tím, že tato otázka jde k jádru chápání vědců o základní jednotce života. Někteří výzkumníci odmítají myšlenku, že buňka je jednoduchým součtem genové exprese, jak naznačují atlasy založené na sekvenování RNA. Jiní tvrdí, že je také nutné zvážit, jak buňka v průběhu času prochází různými stavy. Ale většina se shoduje na jedné věci, komentuje Barbara Treutlein, bioložka mnohobuněčných systémů ze Švýcarského federálního technologického institutu. „Všichni souhlasí, že je to nesmírně obtížné.“

Takové boje o klíčové definice jsou jen stěží jedinečné pro buněčnou biologii: taxonomové se po staletí potýkali s otázkou „co je to druh“ a genetici se museli potýkat s problémem „co je gen, když je dogma, že jeden gen? produkuje jeden protein začal kolabovat před několika desítkami let. V průběhu historie buněčné biologie se seznamy buněčných částí objevovaly v různých obměnách, které odrážely převládající technologii té doby. Kolem roku 1900 se mikroskopie stala královnou biologie a výzkumníci jako španělský histolog Santiago Ramon y Cajal načrtli buňky a začali je seskupovat podle vzhledu. Například některé obyčejné hvězdicové mozkové buňky se začaly nazývat astrocyty nebo hvězdné buňky.

V důsledku revoluce molekulární biologie, která nabrala na síle v polovině 1990. let, se vědci naučili klasifikovat buňky na základě omezeného souboru molekulárních markerů. Astrocyty se tak staly buňkami, které produkují gliální fibrilární kyselý protein nebo GFAP, který lze snadno vizualizovat obarvením buněk nebo označením genu GFAP zeleným fluorescenčním proteinem. Pak přišla metoda sekvenování jednobuněčné RNA, poprvé publikovaná v roce 2009. Dnes mohou mapovači buněk identifikovat astrocyty podle různých RNA, které exprimují, což je přístup, který má paralely s použitím komparativní genomiky k pochopení evoluce druhů. Žádný z těchto nástrojů však nehovoří o tom, co dělají astrocyty – udržují neurony a synapse.

Purkyňovy neurony (tyrkysové) v cerebellum, oblasti mozku, která řídí pohyb a další funkce Foto: Thomas Deerinck, NCMIR/Science Photo Library

Není snadné seskupovat buňky podle funkce. Podle Anne Westové, neurovědkyně z Duke University, jedním typem buněk, který je často klasifikován podle funkce, jsou neurony, které se často dělí podle chemických látek, které uvolňují (jako je dopamin nebo serotonin). Ale mnoho neuronů produkuje stejné neurotransmitery, například v polovině 2000. století vědci diskutovali o tom, kolik typů neuronů produkovalo neurotransmiter GABA; skóre se pohybovalo od čtyř do . mnoho. West očekává, že pokračující práce na jednotlivých buňkách a expresi RNA v mozku pomůže dosáhnout konsensu.

Nicméně buněčná funkce může být v zásadě nejlepším způsobem, jak určit typ buňky, tvrdí Joshua Sanes, neurolog z Harvardu. A jednou z funkcí buňky, dodává Treutlein, je její reakce na prostředí. V živé tkáni jsou buňky neustále vystaveny signálům, které je mohou ovlivnit, jako jsou metabolity, hormony nebo patogeny. „Jaký je typ buňky, můžete skutečně pochopit, jen když víte, jak reaguje,“ říká Treutlein. „Všechny tyto stavy dohromady ti řeknou, jaká je.“ Navrhuje, aby budoucí atlasy buněk obsahovaly informace o tom, jak buňky reagují na takové změny, například jak mohou buňky změnit svou vývojovou trajektorii v reakci na léčbu drogami.

Bohužel, buněčné odezvy a funkce nejsou u mnoha typů buněk zřejmé a mohou být přechodnými charakteristikami. Jejich studium trvá dlouho a buňky často mění svou funkci, když jsou přeneseny z celého organismu do laboratorních podmínek k cílenému studiu. To nutí vědce, aby přijali praktičtější kritéria pro typizaci buněk a vysvětluje dominanci standardizovaných molekulárních metod – většinou jednobuněčné sekvenování RNA, stejně jako metodu vyvinutou Buenrosterem a dalšími pro studium balení DNA a prostorové metody, které spojují tyto molekulární markery. k umístění buňky v tkaninách. Kombinací těchto přístupů jsme „skutečně předefinovali, jaké typy buněk jsou,“ říká Sarah Teichmannová, genomická bioložka a biofyzika z University of Cambridge a spolupředsedkyně projektu Human Cell Atlas.

Tento nový molekulární přístup přinesl vzrušující výsledky, které slibují přepsat mnohé z toho, co buněční biologové vědí o těle. Zatímco se tedy vědci dříve domnívali, že v lidském těle je asi 200 typů buněk, loni Zeng a kolegové identifikovali více než 5 shluků RNA – a tedy potenciálních typů buněk – jen v myší mozkové kůře.

Cílené úsilí také umožňuje objevovat nové typy i v dobře prozkoumaných tkáních. Například asi před 10 lety Sanes a jeho kolegové začali studovat typy buněk v myší sítnici pomocí jednobuněčného sekvenování RNA. V té době se vědci domnívali, že jich bylo asi 65; nová analýza identifikovala nejméně 130. Předtím výzkumníci pravděpodobně postrádali vzácnější typy nebo velmi podobné typy, které by molekulární techniky mohly rozlišit, navrhuje Sanes. Sanes a jeho kolegové nyní porovnávají retinální atlasy různých druhů. Buněčné atlasy také přímo ovlivňují lékařský výzkum. Dvě nezávislé výzkumné skupiny objevily vzácný nový buněčný typ, který se může potenciálně podílet na rozvoji cystické fibrózy; další skupina profilovala a mapovala kardiostimulátorové buňky v srdci.

Během pandemie COVID-19 se mnoho výzkumníků obrátilo ke studiu viru SARS-CoV-2, říká Aviv Regev, počítačový a systémový biolog a vedoucí výzkumu a raného vývoje v biotechnologické společnosti Genentech, která spolupořádá Atlas of Lidské buňky. Výzkum identifikoval různé typy buněk, které jsou náchylné k infekci, a ukázal, jak se jejich buněčné reakce zrcadlí nebo liší od reakcí u jiných onemocnění. Regev říká, že Genentech již používá data z atlasu buněk při vývoji léků. Jedna skupina výzkumníků například testuje lék na léčbu plicních onemocnění, který se váže na receptor nalezený na plicních buňkách. Ale po prostudování buněčného atlasu vědci našli stejný receptor ve více buňkách umístěných ve střevech, což má důsledky pro zánětlivé onemocnění střev. To je vedlo k tomu, že zkusili stejný lék k léčbě této nemoci. Bez tohoto zdroje by si podobnosti nikdy nevšimli, je si jistý Regev.

Kromě hledání léků a touhy po inventarizaci těla vyvolává otázka typu buněk hlubší problém: co je základní jednotkou života? „Řekl bych, že obecně existují dva tábory vědců,“ říká Itai Yanai, systémový biolog z New York University. „Jeden tábor se dívá na buňky a druhý na geny.“

Jedním z těch, kteří jsou pevně oddáni buněčné orientaci, je Alfonso Martínez Arias, vývojový biolog z Katalánského institutu pro výzkum a pokročilý vývoj v Barceloně ve Španělsku. Říká, že sekvenování jednobuněčné RNA vytváří pohled zaměřený na geny, který odvádí pozornost vědců od jiných otázek. „Myslím, že buňka je víc než jen sbírka RNA, kterou obsahuje,“ říká Arias. Například, když pěstuje buňky pro simulaci raného embrya, profily RNA ve 2D kulturách se liší jen málo od profilů ve 3D organoidech, říká, ačkoli 3D verze mají zcela odlišnou strukturu a organizaci.

Pro vědce jako Yanai jsou však geny základní jednotkou života a buňky jsou projevem těchto genů. Katalogizace typů buněk podle RNA tedy dává smysl: „Řekněte mi, jaké geny jsou zapnuté, a já vám řeknu, o jaký typ buňky se jedná,“ říká. Například říká, že kožní buňky zvané melanocyty, které produkují pigment, exprimují specifický „melanocytový modul“ genů.

Klky v tenkém střevě, které pomáhají absorbovat živiny z potravy. Foto: Thomas Deerinck, NCMIR/Science Photo Library

Dalším kritériem pro určení typu buňky je fyzický stav genomu v jádře: jak genom tvoří smyčky a zatáčky, přičemž některé geny jsou přístupné a jiné uzavřené, a jak se určuje, které geny jsou dostupné pro transkripci. Ale i toto uspořádání genomu je řízeno jinými geny a proteiny umístěnými „proti proudu“. Lze tyto regulační molekuly považovat za skutečný základ buněčných typů? Myslí si to Günter Wagner, evoluční biolog z Vídeňské univerzity.

Wagner a jeho kolegové mají teorii: Typy buněk jsou řízeny velkými komplexy transkripčních faktorů a dalšími molekulami nazývanými jádrový regulační komplex neboli CoRC. Tato velká spleť interagujících regulátorů táhne za řetězce DNA, zapíná některé geny a jiné potlačuje, a tak určuje rozložení chromatinu, profil RNA – a typ buňky. CoRC byly identifikovány pro několik typů buněk, jako jsou nervové buňky a krevní buňky, ale není jasné, jak univerzální je tento koncept, řekl Wagner. Má podezření, že CoRC identifikují kratší seznam typů buněk než shluky na základě jednobuněčné analýzy.

Pokud jde o současné zaměření na sekvenování RNA, Teichmann uznává, že kritika není bezdůvodná. „Samozřejmě, že typ buňky není jen o profilu RNA,“ říká. Poznamenává, že Human Cell Atlas plánuje zahrnout různé metody typizace buněk; Analýza RNA byla pouze první, která byla k dispozici. To je důležité, říká, protože RNA odráží další aspekty buněčné biologie, včetně uspořádání chromatinu a složení proteinů.

Typy buněk jsou často popisovány podle jejich aktuální příslušnosti. Ale minulost a budoucnost buňky jsou stejně důležité, dokonce i buňky se zdánlivě stabilní identitou se mohou vyvinout v různé typy – jako jsou imunitní buňky, které jsou aktivovány k boji s infekcí, nebo se dokonce za určitých podmínek stanou rakovinnými.
Buněčná minulost je samozřejmě velmi zajímavá pro biology, kteří studují, jak se jednotlivá buňka dělí a vyvíjí, aby vytvořila nejprve embryo a poté celou bytost. Proto by konečnou reprezentací buněčných typů měla být struktura podobná stromu, zakořeněná v první buňce těla a končící zralými typy na špičkách větví, říká Jay Shendur, vývojový genetik z University of Washington v Seattlu. Seznam podrobností v atlasu, řekl, „nevěnuje náležitou pozornost konceptu času a konceptu kontinuity“.

Výzkumníci začínají vytvářet data, která budou tvořit základ takových stromů. Například v letošní studii Shendur a kolegové sledovali transkriptomy myších embryí od raného vývoje po narození a dále. Zjistili významné změny v RNA exprimované v buňkách do hodiny po narození, pravděpodobně proto, že se zvířata musela přizpůsobit životu mimo dělohu. Sledování typů buněk podél vývojových linií má však svá úskalí. Existují vzácné případy, kdy se typy, které se zdají identické, mohou vyvíjet podél různých trajektorií. A stále není jasné, jak klasifikovat přechodné formy.

Je třeba vzít v úvahu i takovou přechodnou vlastnost buňky, jako je její stav. Buněčný typ může zůstat stejný, zatímco jeho stav se radikálně změní, řekněme z nově zrozené buňky na buňku, která se znovu dělí, nebo z klidové buňky na aktivovanou, takže odlišení nestabilních buněčných stavů od skutečných buněčných typů může být velmi obtížné. . Pokud různé technologie neklasifikují buňky stejným způsobem a každá buňka je jednotlivec na nejjemnější úrovni, co je pak typ buňky? Koncept se stále zdá vágní, ale tak by to mělo být, říká Allon Klein, systémový biolog z Harvard Medical School. Říká, že koncept může být „extrémně užitečný a špatně definovaný“.

Je to proto, že nakonec neexistuje jednoduchá pravda, příroda nevytvořila úhledný seznam částí, jako by to udělal lidský inženýr, a jakýkoli pokus o rozlišení mezi typy je v určitém smyslu umělý.

Totéž lze říci o pokusech taxonomů identifikovat druhy: tato otázka nikdy nezmizela, poznamenává Klein, ale odpovědi se měnily, když byla k dispozici genetická data. Klein věří, že něco podobného se stane v buněčné biologii.

Výzkumníci již přicházejí s jemnějšími způsoby, jak detekovat a vysvětlit buněčné variace. Buenrostro a Regev začali na buňky nahlížet ne tak jako na členy specifického typu, ale jako na soubor jedinců založených na modulech nebo procesech, které daná buňka v určitém okamžiku provádí. Buňka tak může provádět, řekněme, stabilní „fibroblastový“ program se superpozicí stavů „aktivace k opravě rány“ a „buněčného dělení“.

Moduly, které jsou pro konkrétního výzkumníka důležité, budou záviset na jeho zájmech a perspektivách. Proto je metafora buněčného „atlasu“ tak vhodná. Stejně jako geografický atlas integruje přírodní rysy, politické hranice a další koncepty, mohou buněčné atlasy integrovat různé verze buněčné identity – bez ohledu na úhel pohledu uživatele a kam směřují.